引物設(shè)計(jì)的原則：

1.引物長(zhǎng)度：一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的zui適溫度。

2.引物的特異性：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。

3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過(guò)2度。退火溫度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)

4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物的3′端：引物的延伸是從3′端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾；引物3’端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高； 引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗

6.引物的5′端：引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。