微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個因素而設計的。以下來了解微生物菌種凍干保藏方法。凍干機適用于大多數(shù)細 菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。生物菌種凍干保存步驟，其操作流程如下：

1、安瓿管準備

安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅 菌15-20分鐘，備用。

2、保護劑的選擇和準備

保護劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅 菌方法。如血清，可用過濾滅 菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。

3、凍干樣品的準備

在適宜的培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規(guī)程》(試行))，與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內(nèi)分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。

4、預凍

一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。

5、冷凍干燥

采用凍干機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。

終止干燥時間應根據(jù)下列情況判斷：

安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀；

真空度接近空載時的高值；

樣品溫度與管外溫度接近；

選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結(jié)；

選用一個安瓿管，裝1-2%氯-化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結(jié)；

冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。

6、真空封口及真空檢驗

將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

7、保藏

安瓿管應低溫避光保藏。

8、質(zhì)量檢查

冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、**能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。