提高逆轉錄保溫溫度：

較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對于多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴增可以使用 ThermoScript逆轉錄酶，并將逆轉錄反應置于較高溫度下進行以改善擴增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物(GSP)進行cDNA合成時(見第三章)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，并加入預熱的2×的反應混合物提高特異性(cDNA熱啟動合成)。這種方法有助于防止較低溫度時所發(fā)生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化 RT-PCR所需的多種溫度切換。

Tth熱穩(wěn)定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在高65℃條件下保溫。然而，PCR過程中Mn2+的存在會降低忠實性，這使得Tth 聚合酶不太適合用于高精 確度的擴增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉錄效率較低，這會降低靈敏度，而且，既然單個酶就可以進行逆轉錄和PCR，那么沒有逆轉錄的對照反應就不能用來將cDNA的擴增產物同污染的基因組DNA的擴增產物區(qū)分開來。