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蛋白質(zhì)免 疫印跡(WB)操作步驟
日期：2024-11-22 01:15
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摘要： 蛋白質(zhì)免 疫印跡（Western blot）是一種常用于研究中分離和鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù)。WB操作步驟：
一、配膠
1、注意一定要將玻璃板洗凈，用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。
分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可...
蛋白質(zhì)免 疫印跡（Western blot）是一種常用于研究中分離和鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù)。WB操作步驟：
一、配膠
1、注意一定要將玻璃板洗凈，用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。
分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。
2、封膠：
灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動。
待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清 除殘留水滴。片刻后倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。
3、灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。
(10%的AP現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，棄掉.)
一、配膠
1、注意一定要將玻璃板洗凈，用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。
分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。
2、封膠：
灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動。
待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清 除殘留水滴。片刻后倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。
3、灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。
(10%的AP現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，棄掉.)