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轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2C多肽定量試劑盒說明書

試驗原理：
ES試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知ES濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將ES和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中ES的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

特點：

一、高效、靈敏、特異的抗體;

二、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性;

三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體;

四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標(biāo)本類型;

操作步驟：
1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

4、敏感度： 0.1 pg/ml

結(jié)果判斷與分析：
1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的ES標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的ES含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測值范圍：0-240pg/ml

操作注意事項：
1． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。ELISA實驗中有三種必要的試劑：

① 固相的抗原或抗體（用于結(jié)合到固相載體上）

② 標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）

③ 作用的底物（顯色劑，用于顯色）

四種常見ELISA方法

1.直接ELISA

將抗原固定于ELISA板上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。

相較于其它類型的ELISA實驗，直接ELISA實驗步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，測定結(jié)果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會與ELISA板結(jié)合，實驗背景會比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗，信號沒有被放大，降低了測定的靈敏度。

2.間接ELISA

先將抗原結(jié)合到ELISA板上，隨后分兩步進(jìn)行檢測：首先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測并利用底物顯色。

與直接ELISA相比，間接ELISA用到酶標(biāo)二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標(biāo)記抗體，更經(jīng)濟(jì)。間接ELISA還提供了更大的靈活性，因為不同的一抗能夠與單一標(biāo)記的二抗一同使用。間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合），可能會增加背景，同時與直接ELISA相比，間接ELISA實驗多了二抗孵育的步驟，實驗周期延長。

3.夾心ELISA

先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中，然后加入樣品，接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱為直接夾心ELISA；如果檢測抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA。

夾心ELISA的靈敏度高，它比直接或間接ELISA敏感2-5倍；同時夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合，擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進(jìn)行檢測，靈活性較高。夾心ELISA的缺點是對配對抗體要求很高，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體，則需要進(jìn)行配對抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化，因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。

4.競爭ELISA法

預(yù)先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體；如果待檢測物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標(biāo)抗體，最后加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比。

競爭ELISA相對以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些，但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式。其主要優(yōu)點在于可檢測不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。

ELISA常見問題與解決方法

1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果

① 樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑，小心操作。

② 酶標(biāo)板洗滌不徹底——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔，確保能充分洗滌。

③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當(dāng)濃度。

2．酶標(biāo)板整體背景高

① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

② 底物結(jié)合濃度過高——對底物進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

③ 反應(yīng)時間過長——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng)，適當(dāng)縮短顯色時間。

④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染，應(yīng)更換新的底物溶液。

⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。

3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差

① 樣品數(shù)量不整齊，加樣時間有長有短——加重復(fù)孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。

② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，并且使用同一移液槍。

③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時，操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

4. 吸光值偏高或偏低

① 樣品中待測抗原含量太低會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

② 加入抗體量不合適會造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的最適用量。

③ 孵育時間太短導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低——適當(dāng)延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合。

④ 孵育溫度不適合——應(yīng)保證抗體在最適宜條件下進(jìn)行孵育（一般37℃孵育1h）。